Исследование сосудисто-тромбоцитарного гемостаза

Нарушения в этом звене гемостаза могут протекать с наклонностью к геморрагиям или к тромбозам, в зависимости от чего подбираются методы исследования. Кроме того, все методы исследования тромбоцитарного гемостаза подразделяются на основные и дополнительные, или тесты второго ряда, которые применяются лишь в том случае, если с помощью тестов выявлены какие-либо нарушения. К основным (базисным) относятся нижеприведенные тесты.

Пробы на резистентность (ломкость) капилляров — манжеточная, баночная, ангиорезистометрия

Из этих тестов наиболее доступна и вместе с тем достаточно информативна проба Кончаловского—Румпель—Лееде.

Оценка производится по числу и размеру геморрагий, образовавшихся на верхней части ладонной поверхности предплечья (в круге диаметром 5 см) после 5-минутного сдавливания плеча манжетой при давлении 12—13,3 кПа (90—100 мм рт. ст.). Результаты учитываются через 5 мин после снятия манжеты. Число петехий более 10 указывает на повышенную ломкость микрососудов, что часто связано с тромбоцитопенией или нарушением ангиотрофической функции тромбоцитов. Учитывается также возникновение геморрагий и под самой манжетой.

Баночная проба выполняется на тех же участках кожи при ступенеобразном наращивании отрицательного давления — от 20 кПа (150 мм рт. ст.) и ниже. При оценке результатов подсчитываются петехии, появившиеся под банками.

Пробы на длительность и величину капиллярного кровотечения

При классической пробе Дьюка нижний валик мочки уха после легкого ее согревания прокалывается на глубину 3,5—4 мм. Время кровотечения при таком исследовании в норме не превышает 4 мин, а капли крови на фильтровальной бумаге сравнительно невелики и начинают быстро уменьшаться примерно начиная с 1—1,5 мин после прокола. При выраженных тромбоцитопениях (менее 20 Г в 1 л) и тяжелых дисфункциях тромбоцитов время кровотечения увеличивается до 20—40 мин, пятна крови становятся значительно большими и длительно не уменьшаются либо волнообразно то уменьшаются, то вновь увеличиваются. Проба Дьюка недостаточно чувствительна, у 2/3 больных с тромбоцитопатиями она дает нормальные результаты.

Более чувствительны пробы, в которых время кровотечения исследуется на фоне искусственно созданного венозного стаза, для чего на плечо накладывается манжета от аппарата для измерения артериального давления и в течение всего исследования поддерживается давление, равное 5,3 кПа (40 мм рт. ст.). На фоне такого стаза в пробе Борхгревинка—Ваалера на ладонной поверхности верхней трети предплечья наносятся скарификатором поперечные насечки глубиной 1 мм и длиной 8—10 мм (норма времени кровотечения — до 10 мин), а в пробе Айви с соавт. в той же области предплечья наносится ланцетом для взятия крови из пальца три поперечных прокола глубиной 3 мм (норма времени кровотечения — до 7 мин).

На фоне такого же венозного стаза выполняется исследование по А. С. Шитиковой, при котором в концевую фалангу пальца наносится укол глубиной 3 мм, после чего кончик пальца погружается в стаканчик с 5 мл изотонического раствора хлорида натрия и учитывается время кровотечения в проходящем свете (если раствор очень интенсивно окрашивается кровью, то для дальнейшего наблюдения палец перемещается в другой такой стаканчик). Количество потерянной крови определяется по приросту объема жидкости в стаканчиках (норма времени кровотечения — до 4 мин, объема потерянной крови — от 0,01 до 0,4 мл).

В тесте по Г. Н. Сушкевичу объем теряемой крови определяется по окраске раствора аммиака (0,04 %) , в который погружаются бумажки с пятнами крови, путем колориметрирования на медицинском колориметре.

Показания тестов на длительность кровотечения, отклоняющиеся от нормы, свидетельствуют о выраженном нарушении тромбоцитарно-сосудистого гемостаза, однако при нормальных результатах этих проб не исключается наличие нерезко выраженных тромбоцитопатий.

Подсчет количества тромбоцитов в крови

Подсчет количества тромбоцитов в крови (в счетной камере Горяева при фазовом контрасте или с подкраской либо с помощью счетчиков частиц) — важнейший способ диагностики тромбоцитопений и тромбоцитопатий, протекающих с постоянным или периодическим уменьшением количества этих клеток (аномалии Бернара—Сулье, Мея—Хегглина и др.).

Подсчет числа тромбоцитов также подсказывает, можно ли проводить их дальнейшее функциональное исследование и каким способом оно должно быть выполнено (с предварительным концентрированием тромбоцитов или без него, фотометрически или микроскопически и т. д.).

Изучение размеров тромбоцитов в мазке - тромбоцитометрия

Изучение размеров тромбоцитов в мазке (тромбоцитометрия) позволяет составить предварительное суждение о разных популяциях этих клеток в крови исследуемого и получить информацию о ряде их аномалий, а также о насыщении тромбоцитов гранулами.

При некоторых тромбоцитопатиях (синдроме Вискотта—Олдрича) в крови преобладают очень малые тромбоциты (до 2 мкм в диаметре), при других — гигантские формы (аномалии Бернара—Сулье, Мея—Хегглина) — до 8 мкм и более. При ряде тромбоцитопатий эти клетки бедны гранулами (см. ниже), при других — нарушена централизация гранул при распластывании тромбоцитов на стекле, что свидетельствует о нарушении реакции освобождения гранул и содержащихся в них веществ, необходимых для осуществления гемостаза. Все эти свойства, а также способность тромбоцитов к распластыванию и образованию отростков, оценка структуры этих клеток могут быть изучены с помощью обычной и сканирующей электронной микроскопии, а также с помощью интерференционной оптики по Номарскому.

Ретракция кровяного сгустка закономерно нарушается при выраженной тромбоцитопении (менее 30—40 Г в 1 л) и при некоторых формах качественной неполноценности тромбоцитов, чаще всего — при тромбоцитоастении Гланцманна, уремической тромбоцитопатии и др.

Исследование адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов (ААФТ)

Исследование адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов (ААФТ) — важнейшее звено лабораторной диагностики большинства тромбоцитопатий. В настоящее время разработан ряд легко выполнимых и общедоступных методов исследования, включающий визуальную, микроскопическую и аппаратную (агрегометры, микрофильтры и др.) регистрацию этой функции к ориентировочным могут быть отнесены следующие методики.

Методы ретенции тромбоцитов на стекле (или фильтрах)

Проводится подсчет тромбоцитов в венозной крови до и после пропускания ее с о пределенной скоростью через стандартную колонку со стеклянными шариками или через косичку из стекловолокна; по убыли тромбоцитов из крови судят о степени их адгезивности.

Более доступен, хотя и несколько менее точен, метод определения числа тромбоцитов в крови до и после контакта ее в течение определенного срока с внутренней поверхностью колбы, вращающейся с определенной скоростью. Более точны методы определения задержки тромбоцитов на миллипорных фильтрах (диаметр пор — 15—20 мкм). При этих тестах оценка может проводиться по нарастанию градиента давления выше и ниже фильтра (закупорка пор тромбоцитами и их агрегатами ведет к увеличению этого показателя).

Методы исследования агрегационной функции тромбоцитов

Гемолизат-агрегационный тест основан на способности гемолизата отмытых эритроцитов, исследуемого в разведении 10^-2 и 10^-6, вызывать при помешивании агрегацию в его же плазме, одержащей большое количество тромбоцитов (соотношение объемов цитратной плазмы и гемолизата — 1,0:0,2). Учитываются время появления агрегации (норма при высокой концентрации гемолизата—11—17 с, при низкой — 40—54 с) и ее выраженность. Динамика процесса и его интенсивность могут оцениваться также фотометрически (медицинский колориметр, зеленый светофильтр, помешивание) и на агрегографе любой конструкции.

При графической регистрации процесса использование высокого разведения гемолизата (10^-6) позволяет получить двухволновую агрегатограмму, в которой вторая волна связана с выходом из тромбоцитов эндогенных стимуляторов агрегации — АДФ, катехоламинов, тромбоксана и др. Эта вторая волна характеризует реакцию освобождения, ее не наблюдается при отсутствии в тромбоцитах плотных гранул (болезни пула хранения) или при нарушении реакции освобождения (аспириноподобный синдром и др.).

Гемолизат-агрегационный тест доступен для выполнения в любой лаборатории, не требует никаких специальных реактивов.

Визуальный микрометод определения агрегации тромбоцитов

Сущность его состоит в том, что полученная в условиях силиконирования венозная кровь стабилизируется двойным объемом 3,8 % цитрата натрия (соотношение 2,4:0,6 мл), ее центрифугируют 6 мин при 100 об/ /мин, после чего полученную богатую тромбоцитами плазму наносят по 0,02 мл на предметные стекла и смешивают с таким же объемом агрегирующих агентов — АДФ, тромбином, коллагеном, норадреналином или ристомицином. Конечные концентрации агрегирующих агентов в исследуемой плазме крови должны составлять:

• АДФ 0,5*10^-4 ммоль/л;
• норадреналина — 0,015%;
• тромбина — 0,125 ед/мл (концентрация коллагена подбирается опытным путем).

Возможно испытание как более низких, так и более высоких концентраций агрегирующих агентов. Подбор их концентрации может варьировать в зависимости от неодинаковой активности препаратов различного производства и при разной активности образцов, в связи с чем необходима предварительная подгонка концентрации каждого агента на нормальной плазме.

Смесь богатой тромбоцитами плазмы крови агрегирующего агента перемешивается покачиванием предметного стекла, на темном фоне с помощью лупы регистрируется время появления агрегатов в виде «снежной бури». При оценке результатов учитывается число тромбоцитов в плазме. Так, время АДФ-агрегации, возрастает с 27—37 с при 400 Г в 1 л тромбоцитов до 62—75 с при 50 Г в 1 л, а тромбин-агрегации — соответственно с 40—52 до 79— 106 с.

Графическая регистрация процесса агрегации

Графическая регистрация процесса агрегации под влиянием тех же агрегирующих агентов — весьма информативный метод функционального исследования тромбоцитов. Выполняется на агрегографах или.

При графической регистрации определяют не только время наступления агрегации, но и ее интенсивность (по величине отклонения кривой и площади агрегатограммы), наличие первой и второй волны агрегации — при использовании малых концентраций адреналина и АДФ (вторая волна характеризует реакцию освобождения), а также патологической дезагрегации.

Визуальное или графическое исследование агрегации тромбоцитов под влиянием ристомицина

Весьма важным является визуальное или графическое исследование агрегации тромбоцитов под влиянием ристомицина. Нарушается этот вид агрегации (конечная концентрация ристомицина 0,8—1,0 мг/мл) при одном из наиболее распространенных геморрагических диатезов — ангиогемофилии (болезни Виллебранда), а также при аномалии тромбоцитов Бернара—Сулье и при некоторых приобретенных видах угнетения синтеза фактора Виллебранда (уремия, иммунная ингибиция его и т. д.).

Количественное определение фактора Виллебранда в плазме крови

Количественное определение фактора Виллебранда в плазме крови проводится по ристомицин-агглютинации взвеси нормальных формалинизированных тромбоцитов в различных разведениях исследуемой бестромбоцитарной плазмы.

Метод важен как для диагностики ангиогемофнлии и вторичного угнетения синтеза этого фактора, так и для оценки тяжести поражения эндотелия (васкулиты, атеросклероз и др.) и наклонности к тромбозам, при которых содержание фактора Виллебранда в крови часто значительно повышается.

Уровень фактора Виллебранда свидетельствует о способности эндотелия синтезировать его (снижен при аигиогемофилии) и о степени поражения эндотелия при васкулитах, атеросклерозе и других заболеваниях, протекающих с поражением внутренней оболочки сосудов.

Для получения фиксированных нормальных тромбоцитов к богатой тромбоцитами плазме крови здоровых лиц добавляются последовательно 0,2 % раствор ЭДТА (0,5 мл на 5 мл плазмы) и через 2 мин — фиксирующий раствор (20 мл 40 % формалина в 1000 мл фосфатного буфера с 0,2 г ЭДТА, рН 6,4).

Смесь выдерживается при температуре +4°С не менее 1 ч, после чего она подвергается центрифугированию, удаляется надосадочная жидкость, а тромбоцитарный осадок дважды отмывается суспензирующим раствором (один объем 3,8 % раствора цитрата натрия и пять объемов изотонического раствора хлорида натрия; pH доводится до 7,4). Приготовленная взвесь нормальных формалинизированных тромбоцитов фасуется по 1 мл и хранится при температуре —20°С. Калибровочная кривая разведения строится с использованием бестромбоцитарной нормальной плазмы, с образцами которой смешиваются формалинизированные тромбоциты. Далее в смеси определяется ристомицин-агглютинация. По калибровочной кривой определяется количество фактора Виллебранда в исследуемой плазме крови. Фиксированные тромбоциты лучше сохраняются при добавлении в консервирующий раствор небольшого количества азида натрия.

Тесты, отражающие спонтанную агрегацию тромбоцитов

При обследовании больных с тромбоэмболиями или с повышенной наклонностью к тромбозу и ишемии в число основных методов включаются тесты, отражающие спонтанную агрегацию тромбоцитов, т. е. возникающую в цельной крови или в плазме крови без добавления агрегирующих агентов.

Для выявления этого феномена при микроскопии мазка крови обращается внимание на соотношение числа отдельно лежащих тромбоцитов и их агрегатов, состоящих из 3—5 тромбоцитов и более. Этот феномен лучше выявляется при просмотре осадка, полученного при интенсивном цеитрифу- гировании богатой тромбоцитами плазмы (20—30 мин при 6000 об/мин), стабилизированной цитратом или ЭДТА-цитратным раствором. Однако более стабильные результаты дают следующие методы определения спонтанной агрегации.

Метод Wu—Hoak

Метод Wu—Hoak основан на том, что кровь из вены набирается в две пробирки, в одной из которых содержится раствор ЭДТА, а в другой — смесь такого же раствора ЭДТА с 4 % раствором формалина. После перемешивания содержимое пробирок отстаивается 30 мин при комнатной температуре.

Во время отстаивания агрегаты оседают, а отдельные тромбоциты остаются в надосадочном слое. После отстаивания подсчитывается число тромбоцитов в надосадочном слое в каждой из пробирок. В норме разница в количестве тромбоцитов в содержимом обеих пробирок не превышает 10—15 %, при повышенной спонтанной агрегации она возрастает.

Метод Н. И. Тарасовой

По методу Н. И. Тарасовой (1984) убыль тромбоцитов из цельной цитратной крови в агрегаты учитывается после 3-минутного взбалтывания ее на встряхивателе АВУ-1 со скоростью 90—100 раз в 1 мин.

В пробирку с 0,5 мл крови, подвергавшейся встряхиванию, вводится 1 мл 1 % раствора формалина в изотоническом растворе хлорида натрия. Вторая пробирка с контролем не подвергается встряхиванию, и в содержащуюся в ней кровь того же исследуемого через 3 мин также вводится раствор формалина.

Кровь в обеих пробирках отстаивается 30 мин, после чего в надосадочном слое подсчитывается число тромбоцитов. В норме разница в количестве тромбоцитов не превышает 20 %, при повышенной наклонности к агрегации она возрастает.

В случаях выявления нарушении при применении основных тестов, характеризующих тромбоцитарный гемостаз, выполняют по мере необходимо провести дополнительные исследования. Из них наиболее важны следующие.

Дополнительные исследования для определения тромбоцитарного гемостаза

Исследование количества мегакариоцитов в миелограмме и трепанате костного мозга с изучением морфологии этих клеток

Значительное увеличение числа мегакариоцитов в срезах костного мозга, обычно сочетающееся с более или менее выраженным увеличением количества тромбоцитов в крови, наблюдается при эритремии, геморрагическом и эссенциальном тромбоцитозе и других миелопролиферативных заболеваниях. Умеренный мегакариоцитоз, сочетающийся с тромбоцитопенией, характерен для тромбоцитопенической пурпуры (болезни Верльгофа).

При аплазии и гипоплазии костного мозга любого генеза снижено как содержание мегакариоцитов в срезах костного мозга, так и количество тромбоцитов в периферической крови.

Парциальный амегакариоцитоз наблюдается при дефиците тромбоцитопоэтина (редкая форма врожденной тромбоцитопении), появлении в крови антимегакариоцитарных антител, эссенциальной парциальной аплазии мегакариоцитов (может предшествовать развитию лейкоза).

Морфологические и цитохимические изменения мегакариоцитов отмечаются при многих тромбоцитопатиях.

Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры тромбоцитов

Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры тромбоцитов имеет значение для диагностики ряда тромбоцитопатий, при которых отсутствуют или резко уменьшается количество небелковых гранул высокой оптической плотности (содержащих АДФ, серотонин, катехоламины, кальций и др.), либо белковых α-гранул, что характерно для ряда тромбоцитопатий, объединяемых в группу болезней пула хранения, или болезней отсутствия гранул.

Могут выявляться также дефекты в контрактильном аппарате (системе микротрубочек) и лизосомах тромбоцитов.

При сканирующей электронной микроскопии или исследовании тромбоцитов с помощью интерференционной оптики по Номарскому могут обнаруживаться также дефекты фиксации тромбоцитов на чужеродной поверхности, их распластывания на ней, образование отростков, централизация и секреция гранул, что характерно для многих видов тромбоцитопатий.

Определение антитромбоцитарных антител путем иммунофлюоресцент- ного исследования в суспензии тромбоцитов иммуноглобулина, связанного с этими клетками - метод Диксона

Этот сложный метод позволяет дифференцировать иммунные и неиммунные тромбоцитопении.

Однако при наиболее выраженных формах заболевания с резкой тромбоцитопенией он неприемлем, так как для определения связанного иммуноглобулина требуется достаточно большое (более 40—50 Г в 1 л) количество тромбоцитов.

Определение продолжительности жизни меченых аутологичных тромбоцитов

Определение продолжительности жизни меченых аутологичных тромбоцитов позволяет разграничивать тромбоцитопении с нормальной продолжительностью жизни тромбоцитов в циркуляции (около 9 суток) и формы заболевания с укороченной продолжительностью жизни этих клеток.

Первые чаще всего связаны со снижением продукции тромбоцитов в костном мозге, вторые — с их ускоренной гибелью, либо с действием антитромбоцитарных антител (при аутоиммунных тромбоцитопениях продолжительность жизни тромбоцитов сокращается до нескольких часов), либо с интенсивной убылью этих клеток в агрегаты и тромбы при диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови или массивных тромбозах (тромбоцитопении потребления).

Количественное определение содержания в плазме крови до и после агрегации тромбоцитарных факторов

Количественное определение содержания в плазме крови до и после агрегации ряда тромбоцитарных факторов — мембранного фосфолипидного фактора 3, содержимого α-гранул (антигепаринового фактора 4, β-тромбоглобулина, митогенного фактора тромбоцитов) и небелковых гранул высокой электронно-оптической плотности (серотонина, катехоламинов, АДФ), а также кислых гидролаз.

Эти исследования дают представление о содержании в тромбоцитах соответствующих структур и их компонентов, об освобождении их в плазму в процессе агрегации, а также о внутрисо- судистой активации тромбоцитов, сопровождающейся выходом из тромбоцитов в плазму крови с повышением концентрации в последней компонентов плотных и α-гранул (антигепаринового фактора 4, β-тромбоглобулина и др.).

Методы количественного исследования тромбоцитарных факторов важны для идентификации ряда тромбоцитопатий (нарушений сохранности гранул и их компонентов, пареза реакции освобождения этих компонентов, повышения содержания их в плазме крови вследствие интенсивной внутри- сосудистой адгезии и агрегации тромбоцитов и др.). Ряд тромбоцитопатий характеризуются снижением содержания в мембранах тромбоцитов фактора 3 либо нарушением его доступности для участия в процессе свертывания крови.

Исследование биохимических особенностей тромбоцитов и отдельных их структур

Исследование биохимических особенностей тромбоцитов и отдельных их структур — стромы, гранул, митохондрий и т. д. позволяют документировать связь разных видов патологии и дисфункции тромбоцитов с определенными видами ферментной недостаточности (дефицитом циклооксигеназы, тромбоксансинтетазы и пр.), с нарушением состава мембранных липопротеинов, необходимых для взаимодействия с агрегирующими агентами, и т. д.

Подобные исследования доступны лишь хорошо оснащенным исследовательским лабораториям и поэтому в широкой практике не применяются.